劉飛 張明晢 曹檳 凌云燕 趙瑞琳*

（中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室，北京 100101）

摘 要 食用菌品種的精準鑒定在食用菌生產(chǎn)和種質(zhì)創(chuàng)新中占有重要地位。食用菌不同品種間存在親緣關(guān)系密切、同質(zhì)化嚴重的問題，而現(xiàn)有的食用菌品種鑒定方法工作量大、精確性和重復(fù)性不足，怎樣實現(xiàn)食用菌品種的精準鑒定是產(chǎn)業(yè)中的痛點問題。多核苷酸多態(tài)性（MNP）分子標記是一種能夠同時檢測DNA序列中多個核苷酸變異的方法，可提供高分辨率的遺傳信息，從而更準確地區(qū)分食用菌不同品種之間的差異，并具有較高的重復(fù)性和精確性。文中分析了該技術(shù)在食用菌品種鑒定中的優(yōu)勢，回顧了2022—2023年MNP分子標記首次在香菇和金針菇等品種的精準鑒定中的應(yīng)用。此外通過分析MNP標記的變異模式，除了品種的精準鑒定外，還可以實現(xiàn)品種溯源，具有巨大的應(yīng)用潛力。通過進一步研究，尤其是和表型組的緊密結(jié)合，MNP分子標記還將為食用菌種質(zhì)資源的保護、育種改良和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供更多的支持和解決方案。

關(guān)鍵詞 MNP分子標記；食用菌；譜系；精準鑒定

食用菌產(chǎn)業(yè)在推動循環(huán)農(nóng)業(yè)和提高農(nóng)民收入方面取得了顯著的成績，已成為我國特色農(nóng)業(yè)發(fā)展中的朝陽產(chǎn)業(yè)。我國作為全球最大的食用菌生產(chǎn)國，2020年的年產(chǎn)量達4 000萬t，占據(jù)全球總產(chǎn)量的3/4。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷推進，食用菌品種的人工選育工作也迅速展開，近年來品種選育和引種栽培等方面的快速發(fā)展，導(dǎo)致出現(xiàn)了食用菌同一品種名稱不同或不同品種名稱相同的現(xiàn)象。以我國食用菌總產(chǎn)量第一的香菇Lentinula edodes （Berk.） Pegler為例，根據(jù)2021年的數(shù)據(jù)，香菇產(chǎn)量達到1 296萬t，占全國食用菌總產(chǎn)量的31%。在對全國11個食用菌主產(chǎn)省市進行調(diào)查時，邊銀丙指出一些香菇品種在栽培過程中會更改品種名稱后繼續(xù)生產(chǎn)和流通，或者通過純種分離、選擇性培養(yǎng)、引種等手段冠以新的品種名稱。這種混淆品種名稱的現(xiàn)象在其他食用菌物種中同樣存在。根據(jù)調(diào)查結(jié)果估計，全國主要香菇產(chǎn)區(qū)可能存在120~150個不同名稱的栽培品種（菌株）。另外，宋曉霞等統(tǒng)計了我國各單位選育的香菇菌株，發(fā)現(xiàn)不同名稱的香菇品種（菌株）已增長至500個。這種品種（菌株）名稱的混亂不僅給食用菌生產(chǎn)帶來了困擾，也對種質(zhì)創(chuàng)新造成了嚴重的阻礙。

準確的品種名稱能夠讓使用者通過品種名查閱到相關(guān)品種的特性、栽培要點等，快速了解所栽培品種的優(yōu)良性狀和適應(yīng)性等必要的信息，提高栽培管理水平。對于食用菌育種工作者而言，準確的品種鑒定在種業(yè)創(chuàng)新中具有重要意義，是食用菌種質(zhì)創(chuàng)新的前提。此外品種鑒定是確保農(nóng)作物品種權(quán)益得以保護的重要環(huán)節(jié)。通過對品種的鑒定和確認，可以確保新培育的品種符合相關(guān)法規(guī)和標準，避免侵權(quán)行為和不當競爭，保障品種創(chuàng)新者的合法權(quán)益。當前食用菌品種鑒定中存在的一系列問題，需要通過加強標準化管理和建設(shè)品種認證體系來逐步解決。隨著食用菌相關(guān)遺傳研究和操作技術(shù)的不斷發(fā)展，利用分子標記等先進技術(shù)在食用菌品種鑒定中的應(yīng)用得以廣泛拓展。這種技術(shù)的應(yīng)用不僅提高了鑒定的準確性和可靠性，還為食用菌產(chǎn)業(yè)的新品種選育、資源保護等方面提供了強有力的技術(shù)支持。

1. 食用菌品種鑒定主要方法與技術(shù)挑戰(zhàn)

目前已實現(xiàn)人工種植的食用菌種類約有100種，其中可以大規(guī)模商業(yè)化種植的約60種，香菇、黑木耳Auricularia heimuer、平菇 Pleurotus ostreatus、金針菇Flammulina filiformis、雙孢蘑菇Agaricus bisporus、刺芹側(cè)耳Pleurotus eryngii與毛木耳Auricularia cornea 7個為大宗物種，產(chǎn)量占到了我國食用菌總產(chǎn)量的83.97%。食用菌普遍采用組織分離復(fù)壯菌株或系統(tǒng)選育法育種，育種采用的親本范圍過窄，使得食用菌品種同質(zhì)化非常嚴重，不同品種（菌株）之間親緣關(guān)系密切，增加了食用菌品種精確鑒定的難度。我國金針菇工廠化生產(chǎn)品種仍主要依賴境外引進，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)品種市場占有率較低。

在食用菌品種鑒定領(lǐng)域，傳統(tǒng)方法主要包括形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定和生物化學鑒定。形態(tài)學鑒定是最常用的方法之一，該方法依賴于觀察食用菌的外部形態(tài)特征，如菌蓋、菌柄、菌褶、孢子印、氣味和顏色等。細胞學鑒定包括對食用菌的細胞結(jié)構(gòu)和細胞核進行研究，通常需要專業(yè)的實驗室設(shè)備和技術(shù)。生物化學鑒定方法涉及對食用菌的生化特性進行研究，如酶活性和化學成分等。然而，這些傳統(tǒng)方法在實踐中容易受到環(huán)境因素和檢測者主觀因素的影響。

基于DNA多態(tài)性的分子標記方法具有更高的多樣性，可以揭示變異和等位基因，受環(huán)境因素和發(fā)育階段的影響較小，已成為品種鑒定的重要手段。目前，包括香菇在內(nèi)的不同食用菌品種鑒定廣泛采用的分子標記方法有限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單序列重復(fù)間區(qū)（Inter simple sequence repeat，ISSR）、特定序列擴增（Sequence characterized amplified regions，SCAR）等。以上分子標記的結(jié)果通常以瓊脂糖凝膠電泳來呈現(xiàn)，根據(jù)是否存在由限制性內(nèi)切酶消化或寡核苷酸引物擴增產(chǎn)生的特定DNA片段進行分析和鑒定。然而，這些方法可用的標記物和特異性的信息較少。

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）標記法和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）在植物品種鑒定中被廣泛使用，也被應(yīng)用于食用菌領(lǐng)域，包括香菇、金針菇和雙孢蘑菇。簡單重復(fù)序列實質(zhì)上是保守的非編碼區(qū)，在進化過程中保持一定的重復(fù)序列，不同的重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度導(dǎo)致了SSR長度的高度變異，從而產(chǎn)生SSR標記或SSLP標記。SSR標記法通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和凝膠電泳進行檢測，在香菇品種鑒定上得到了廣泛應(yīng)用，并被用于構(gòu)建連鎖圖譜以及分析香菇群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。然而該方法存在一些缺陷：如在樣本SSR的PCR擴增中，重復(fù)的SSR可能導(dǎo)致DNA聚合酶滑移，從而使得準確的SSR基因分型變得困難。此外，SSR標記法需要依賴片段長度進行檢測，如果片段長度差異過小，或片段長度相同但內(nèi)部堿基組成不同，電泳也難以準確判斷。同時，SSR的電泳檢測效率較低，一次只能處理少量的SSR，這是因為其標記的檢測通常需要進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，而電泳過程中的分離和檢測需要耗費較多時間和資源。

SNP是目前廣泛應(yīng)用的分子標記方法，指的是基因組DNA序列中單個堿基的變異所導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性，其最低等位基因的頻率為1%或更高。SNP標記法需要借助全基因組測序（WGS）等技術(shù)來檢測大量的SNP位點。該種方法涉及對樣品DNA進行全基因組重測序，以篩選出不同的SNP標記位點。然而此過程需要復(fù)雜的實驗操作和較長的時間，并且對數(shù)據(jù)分析要求較高。目前，僅少數(shù)功能性基因片段的SNP標記被用于香菇等食用菌的品種鑒定。相比之下，使用微陣列技術(shù)檢測SNP存在一些不足之處，包括數(shù)據(jù)缺失、低靈敏度和高假陽性率等問題。此外，微陣列制造成本較高，主要由于材料成本高、制造過程復(fù)雜、高質(zhì)量控制要求和技術(shù)研發(fā)投入大等多因素所致。這些因素使得微陣列分析成為一種高成本的研究方法。

InDel是另一種重要的分子標記方法，指的是核酸水平上1個堿基序列以上的插入或缺失所導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性。InDel標記的分布及密度高于SSR標記，但低于SNP標記。近年來，研究人員開始采用InDel分子標記方法對香菇進行品種鑒定。然而，InDel標記在基因組研究中的準確鑒定受多個因素的影響，包括結(jié)構(gòu)基因組特征、重復(fù)序列、短散在元件（Short interspersed elements）以及所使用的InDel檢測方法的質(zhì)量等。因此，開發(fā)和使用InDel標記方法的難度較大。

綜上，食用菌品種鑒定方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學、細胞學、生物化學，以及基于分子標記的方法。傳統(tǒng)方法易受環(huán)境因素和檢測者主觀因素的影響，工作量大且準確性和重復(fù)性有限。分子標記方法中，SSR標記法已被廣泛應(yīng)用并具有較高的變異性，但在PCR擴增中容易出現(xiàn)滑移導(dǎo)致基因分型困難，且電泳檢測效率較低。SNP標記法也是目前廣泛應(yīng)用的方法，但全基因組測序成本較高且微陣列技術(shù)存在缺陷。InDel標記法具有一定的優(yōu)勢，但準確鑒定受多個因素影響，應(yīng)用難度較大?？傮w而言，食用菌品種鑒定依舊面臨工作量大、精確性和重復(fù)性不足的問題。

2. MNP分子標記在食用菌品種精準鑒定中的優(yōu)勢和應(yīng)用

多核苷酸多態(tài)性（Multiple nucleotide polymorphism，MNP）標記法建立在單核苷酸多態(tài)性標記的基礎(chǔ)上。該方法已成功應(yīng)用于水稻、大豆、油菜、茄子、玉米、番茄等作物的品種鑒定，并于2020年成為植物品種鑒定的國家標準之一（《植物品種鑒定 MNP標記法》，GB/T38551-2020）。MNP標記法的基本原理是利用基因組中存在的多個SNP位點，通過組合不同SNP位點的等位基因型來區(qū)分不同個體之間的DNA序列差異。

MNP標記法在品種精準鑒定中具有以下優(yōu)勢。首先，相較于其他分子標記法，MNP標記法具有更高的準確性，這是由于MNP位點的篩選基于同物種不同品種的基因組重測序數(shù)據(jù)，相較于傳統(tǒng)的SSR標記，其能夠更全面地覆蓋變異位點，避免了易于出錯的SSR和連續(xù)SNP區(qū)域的問題。其次，基于高通量測序的MNP標記檢測克服了凝膠電泳中SSR擴增長度不確定性和SNP標記微陣列雜交噪聲的問題。此外，MNP位點開發(fā)時需通過二代測序進行多次的重復(fù)檢測，確保了重現(xiàn)性和準確性。當具體物種的MNP標記位點數(shù)據(jù)庫構(gòu)建完成后，在實際操作上僅將待測樣品DNA和混合MNP標記引物在1個PCR體系中進行1次擴增，并測序這些位點的序列即可。所以針對具體物種的MNP標記開發(fā)完成后，后續(xù)對該物種品種的檢測，在實際操作中非常便捷，且鑒定結(jié)果穩(wěn)定可靠。與基于全基因組重測序的SNP分析相比，多重PCR擴增結(jié)合MNP?Seq方法通過對特定DNA片段進行高深度測序，大幅減少了測序和分析時間，同時降低了計算資源需求和成本，使得這種方法具備更高的效率和經(jīng)濟優(yōu)越性。

MNP分子標記的開發(fā)包括樣品DNA提取、全基因組重測序、變異位點檢測和MNP分子標記的篩選。在變異位點檢測和MNP分子標記篩選階段，使用BWA或Bowtie將測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組生成bam文件，利用samtools軟件檢測測序深度和比對率并篩選獲得高質(zhì)量的SNP位點，最后使用Python或Perl腳本以 100 ~150 bp 的長度在全基因組滑動檢測 SNP 多態(tài)性豐富的DNA 序列作為候選 MNP 標記等。開發(fā)出MNP分子標記后，在應(yīng)用中的主要步驟有樣品DNA提取、MNP分子標記的PCR擴增、測序儀中MNP?seq高通量測序、測序數(shù)據(jù)解讀。數(shù)據(jù)的解讀包括對測序儀輸出的原始測序數(shù)據(jù)進行處理和分析，如使用Falco進行質(zhì)量控制、fastp去除低質(zhì)量序列和將序列比對到參考序列上。通過對比樣品中的DNA序列與參考序列的差異，識別和鑒定存在的多態(tài)核苷酸多態(tài)性位點。最后，根據(jù)位點的特征和組合進行數(shù)據(jù)解讀，以完成品種鑒定。

MNP分子標記在食用菌品種的精確鑒定中發(fā)揮了重要作用，可提高鑒定結(jié)果的準確性和可靠性。以香菇、金針菇和刺芹側(cè)耳為例，研究結(jié)果顯示MNP分子標記在以上食用菌品種鑒定中取得了顯著成功。不僅為食用菌領(lǐng)域的遺傳多樣性研究提供了重要支持，也為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。

在香菇品種鑒定方面，Ling等基于植物品種的MNP標記研究方法的基礎(chǔ)上進行了改進，以適應(yīng)食用菌品種鑒定的實際需求，在188個香菇菌株基因組重測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，篩選出501個MNP標記位點。通過相關(guān)引物設(shè)計和對78份香菇商業(yè)品種［包括25個國家品種委員會認定的香菇商業(yè)栽培品種、7個通過地方審定（鑒定、備案）品種，以及具有代表性狀、生物學特性和來自不同地域的栽培菌株］進行多重擴增、MNP?Seq測序，構(gòu)建了我國香菇品種的MNP標記位點數(shù)據(jù)庫。檢測結(jié)果顯示，這些標記的位點檢出率、重復(fù)率和準確率分別為94.4%，99.92%和99.96%，表明其標記效果良好。在此基礎(chǔ)上進一步篩選出187個核心MNP標記位點，并利用240個菌株的核心位點序列構(gòu)建高精度的系統(tǒng)發(fā)育圖譜，計算不同譜系間和品種間遺傳相似度（Genetic similarity，GS）。研究表明，所有供試栽培品種可以被區(qū)分為24個譜系，其中13個譜系的原始栽培品種來自日本，5個譜系來自中國，另有3個譜系來源不明。除唯一來自中國南方的栽培品種（香九）外，大多數(shù)香菇栽培品種原產(chǎn)于東北亞地區(qū)，且中國的香菇品種存在嚴重的同質(zhì)化現(xiàn)象。該研究還劃定了區(qū)分不同譜系和品種的GS標準：當GS值≤94%，為不同譜系的品種；GS值在94%~99.5%，可認為是同一譜系中不同的栽培品種；當GS值>99.5%時，則視為同一栽培品種?；诖耍芯客晟屏讼愎狡贩N精準鑒定的快速流程，實現(xiàn)了簡單的實驗室操作（只需對待測樣品1次DNA提取，1次多重PCR擴增，1次送樣測序）后，即可通過MNP數(shù)據(jù)庫比對完成待測樣品的品種精準鑒定，實現(xiàn)精準快速鑒定香菇品種。該項研究首次將MNP標記技術(shù)應(yīng)用于食用菌品種鑒定，構(gòu)建了我國香菇商業(yè)品種的MNP位點標準數(shù)據(jù)庫，為食用菌品種的有效識別、保護和管理提供了科技支持。

Liu等在金針菇品種鑒定方面取得了重要進展，利用金針菇的全基因組測序數(shù)據(jù)，篩選出179個MNP標記，并構(gòu)建了包含這些標記的MNP序列庫。隨后通過多重PCR擴增和MNP?Seq測序?qū)Y選出的MNP標記進行了分析和驗證。進一步篩選過程中，確定了69個具有較高的鑒別能力的核心MNP標記。基于這些核心MNP標記，構(gòu)建了鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹，以探討232個金針菇栽培品種和野生品系之間的親緣關(guān)系。通過計算遺傳相似度值，結(jié)果表明所有栽培品種均可被準確區(qū)分，并且栽培品種可被分成22個不同進化譜系。該方法的成功開發(fā)不僅對金針菇品種鑒定和進化研究具有重要的意義，還為進一步探索其遺傳多樣性和進化歷史提供了有力證據(jù)。此外，呂志文等還建立了1套以MNP分子標記為基礎(chǔ)的金針菇品種鑒別技術(shù)。

魏傳正等將MNP分子標記成功運用于刺芹側(cè)耳菌株的鑒定，利用32個刺芹側(cè)耳菌株，通過二代測序和標記序列篩選，確定了179個MNP標記。32個菌株之間的遺傳相似度為1.79%~99.60%。拮抗試驗結(jié)果顯示，遺傳相似度高的菌株之間無拮抗現(xiàn)象，各菌株可能屬于極近似品種或相同品種。研究表明，基于二代測序技術(shù)的MNP標記可用于刺芹側(cè)耳菌株鑒別和遺傳相似度分析，為菌株鑒定提供了有效工具。此外，Liu等構(gòu)建了1種基于核心基因相關(guān)多核苷酸多態(tài)性（cgMNP）標記的雙孢菇品種鑒別技術(shù)，進一步拓展了MNP標記在食用菌品種鑒定中的應(yīng)用前景。以上研究成果在食用菌品種鑒定領(lǐng)域具有重要的推廣和應(yīng)用價值。隨著進一步的研究和應(yīng)用，MNP分子標記將為食用菌領(lǐng)域的科學發(fā)展和產(chǎn)業(yè)進步做出更大的貢獻。

3. MNP標記在食用菌品種精準鑒定中的應(yīng)用前景

MNP標記技術(shù)在植物品種鑒定方面已取得了明顯成效，但在食用菌的品種鑒定中仍面臨較大的挑戰(zhàn)。這主要是因為植物的基因組顯著大于真菌基因組，且食用菌品種間同質(zhì)化嚴重，導(dǎo)致對食用菌品種的鑒定標準和精確程度要求更高。研究表明，在植物MNP分子標記的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化改進，能夠?qū)崿F(xiàn)對食用菌品種的精準鑒定。

MNP標記法在食用菌品種鑒定領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）全基因組數(shù)據(jù)分析，通過分析不同菌株/品種的全基因組數(shù)據(jù)，可以獲得不同菌株之間的MNP標記差異，據(jù)此可以準確鑒定和區(qū)分不同的食用菌品種，對于品種保護、品種純度檢測和溯源具有重要意義。（2）優(yōu)質(zhì)特征篩選，MNP標記可以與特定的性狀或優(yōu)質(zhì)特征相關(guān)聯(lián)。通過關(guān)聯(lián)分析，可以鑒定出與產(chǎn)量、抗病性、品質(zhì)等相關(guān)的MNP標記，從而幫助選育出更好的食用菌品種。（3）種質(zhì)資源評估，MNP標記可以用于評估食用菌種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳背景，有助于了解品種間的親緣關(guān)系、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳進化，為保護和合理利用種質(zhì)資源提供依據(jù)。（4）數(shù)據(jù)庫建設(shè)和資源共享，建立食用菌MNP標記數(shù)據(jù)庫并促進數(shù)據(jù)共享，有助于整合不同研究團隊的數(shù)據(jù)資源，提供更全面和準確的品種鑒定工具。

MNP標記可以在食用菌行業(yè)的多個方面提供技術(shù)支持。首先，通過MNP標記可實現(xiàn)品種的精準鑒定，為食用菌的種質(zhì)資源保護和管理提供科學依據(jù)，也有助于創(chuàng)新品種的培育和推廣。此外，在市場監(jiān)管和品牌保護方面，通過MNP標記的品種鑒定，可以有效監(jiān)管市場上的食用菌品種，減少假冒偽劣產(chǎn)品的流通。對于品牌廠商而言，保護自身品牌和產(chǎn)品的知識產(chǎn)權(quán)具有重要意義。如上海某食用菌工廠化栽培企業(yè)發(fā)現(xiàn)市場上有多家公司侵犯其專利權(quán)，大規(guī)模栽培并銷售其專利產(chǎn)品，該企業(yè)提起訴訟后，要求侵權(quán)公司立即停止侵權(quán)行為、銷毀庫存并賠償損失。該維權(quán)案件被業(yè)內(nèi)稱為“中國微生物知識產(chǎn)權(quán)第一案”，為食用菌產(chǎn)業(yè)樹立了維權(quán)的榜樣。此案的勝訴不僅為農(nóng)業(yè)新品種的保護提供了示范，也為中國食用菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展指明了方向。

綜上所述，MNP標記在食用菌品種精準鑒定中具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著產(chǎn)業(yè)標準化管理的推進和品種認證體系的逐步建立，以及分子生物學和基因組學技術(shù)的不斷發(fā)展，MNP標記的應(yīng)用前景將進一步拓展和深化。此外，食用菌DUS測試作為品種鑒定的常用方法，通過評估食用菌品種的形態(tài)特征、生長習性和產(chǎn)量等指標，確保了品種的獨特性、一致性和穩(wěn)定性。將MNP分子標記技術(shù)與DUS測試結(jié)合使用，可以更全面、準確地評估食用菌品種的特性，為科學種植、新品種選育及資源保護提供有力支持。

引用本文：劉飛，張明晢，曹檳，等.MNP分子標記在食用菌品種精準鑒定中的應(yīng)用與前景分析［J］.菌物研究，2025，23（3）：247-253.

作者簡介：劉飛，男，助理研究員，研究方向：大型真菌的生物信息學。

通訊作者：趙瑞琳，E-mail：zhaorl@im.ac.cn

基金信息：“十四五”國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD1200605），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市食用菌創(chuàng)新團隊項目（BAIC03-01），河南省重點研發(fā)專項項目（221111110600）